Stručni tekstovi

Veštačko osemenjavanje

Stručni tekstovi >>

·uzimanje sperme

·kontrola kvaliteta sperme

·brojanje spermetozoida metodom hemocitometrije

·razređenje ejakulata i proizvodnja

·optimalno vreme i tehnika v.o.

·transplantacija embriona

·sexing, određivanje pola spermatozoida i embriona

·fertilizacija in vitro

·postupak dobijanja himera


Igor Prka DVM

decembar 2007.god.

 

Zootehnička i veterinarsko-medicinska metoda ubacivanja doza sperme u određene delove ženskog polnog trakta, primenom određenih instrumenata i tehnika. U širokoj stočarskoj proizvodnji, veštačko osemenjavanje (VO) se koristi većviše od 50 godina. Primena ove metode, doprinela je velikom napretku intenzivne stočarske proizvodnje.

 

Prednosti primene veštačkog osemenjavanja:

·         Brže razmnožavanje (dobijanje većeg broja potomaka) jednog genetski superiornog priplodnjaka

·         Sprečavanje širenja zaraznih bolesti

·         Mogućnost dugotrajnog čuvanja sperme određenog priplodnjaka

·         Jednostavniji i jeftiniji transport sperme, na veće udaljenosti

·         Isključen rizik transporta, adaptacije, aklimatizacije i karantiniranja  priplodnjaka

·         Znatno bolja evidencija porekla potomaka

·         Ekonomske uštede u proizvodnji, zbog potrebe znatno manjeg broja priplodnjaka

·         Mogućnost prodaje doza sperme i ekonomske koristi od toga

·         Mogućnost definisanja pola potomaka, putem sexing-a spermatozoida

·         Mogućnosti naučnih istraživanja

 

Postupci u tehnologiji veštačkog osemenjavanja:

1.      Uzimanje sperme od priplodnjaka se vrši: (a) veštačkom vaginom, (b) manuelnom fiksacijom penisa, (c) elektroejakulacijom i (d) manuelnom masažom ampula semevoda per rectum.

2.      Kontrola kvaliteta dobijenog ejakulata se vrši neposredno posle uzimanja i obuhvata:

      (a) makroskopsku ocenu (volumen, gustina, boja, miris, prisustvo stranih primesa) i

      (b) mikroskopsku ocenu (ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, koncentracija  

      spermatozoida u 1 ml ejakulata, % progresivne pokretljivosti, broj mrtvih i morfološki 

      abnormalnih spermatozoida, eventualno prisustvo mikroorganizama i td.). Broj

      spermatozoida se određuje: hemocitometrijski ili fotometrijski. Mrtvi i morfološki

      abnormalni spermatozoidi se određuju pregledom trajnih histoloških preparata, obojenih

      adekvatnom metodom (po Blom-u, Supravitalno i td.). Svi opisani postupci kontrole sperme

      se vrše u prostoriji sa oko 20-22ºC, dok sama sperma, instrumenti i predmeti koji dolaze u

     direktan kontakt sa spermom, moraju biti zagrejani na 37ºC.

3.      Razređivanje ejakulata se izvodi odmah posle izvršene kontrole. Ejakulat se razređuje zbog toga da se: (a) poveća njegov volumen, kako bi se mogao napraviti veći broj inseminacionih doza određene zapremine i (b) dodaju potrebne hranljive, zaštitne i druge materije, koje će produžiti život i oplodnu sposobnost spermatozoida, tokom njihovog čuvanja in vitro. Za razređivanje se koriste posebni razređivači, čiji sastav i osobine zavise od vrste priplodnjaka, kao i od načina i dužine čuvanja razređene sperme.

4.      Formiranje inseminacionih doza se vrši u zavisnosti od vrste priplodnjaka, upotrebljenog razređivača i načina čuvanja. Volumen inseminacione doze je specifičan za svaku vrstu priplodnjaka. Nativna razređena sperma se razlije u određeni broj doza, koje se stavljaju na temperaturu 170C, ako se čuvaju kratkotrajno (nekoliko sati ili dana) ili se postepeno rashlađuju i podvrgavaju određenoj obradi, ako se želi njihovo dugotrajno čuvanje u zamrznutom stanju (na – 1960C).

5.      Čuvanje razređene sperme može biti kratkotrajno (u tečnom stanju) ili dugotrajno u duboko zamrznutom stanju. Bez obzira na vrstu životinja, primenjen razređivač, te način i dužinu čuvanja, oplodna sposobnost spermatozoida je lošija u spermi koja se čuvala, u odnosu na onu koja se upotrebila neposredno posle uzimanja i razređivanja.

6.      Tehnika inseminacije je jedan od primarnih faktora uspeha veštačkog osemenjavanja, mereno brojem (%) postignute uspešne koncepcije i veličinom rezultirajućeg stada. Izvodi se specijalnim instrumentima (inseminacioni kateteri, vaginalni spekulumi, inseminacione bočice i sl.). Izgled i oblik ovih instrumenata zavise od vrste životinje za koju su namenjeni. Vrhom inseminacionog katetera se ulazi u određen deo ženskog polnog trakta (cervix, telo materice, rog materice), gde se vrši deponovanje doze sperme.

 

UZIMANJE SPERME OD PRIPLODNJAKA

Sperma (ejakulat = zapremina sperme, koju priplodnjak izbaci u jednom skoku, ejakulaciji) se može uzeti od priplodnjaka sledećim metodama: (a) veštačkom vaginom, (b) manuelnom fiksacijom penisa, (c) elektroejakulacijom i (d) masažom akcesornih polnih žlezda.


Manuelna fiksacija penisa se koristi za uzimanje sperme od nerasta. Naime, pokazalo se da nerast slabije manifestuje refleks ejakulacije i daje lošiji kvalitet ejakulata, ako se sperma uzima veštačkom vaginom. To je zbog toga što: (a) nerast ima duže trajanje ejakulacije i (b) što je, za stimulaciju refleksa ejakulacije, kod nerasta, primaran stimulus pritiska, koji nije moguće, u dovoljnoj meri, postići veštačkom vaginom. Zbog toga se, posle erekcije, rukom u rukavici, čvrsto hvata i stiska glans penisa, sve dok nerast ne završi kompletnu ejakulaciju.

Veštačka vagina je specijalna naprava, kojom se imitiraju uslovi u vagini (temperatura, skliskost i pritisak). Ovi faktori su stimulusi za izazivanje refleksa ejakulacije kod mužjaka. Temperatura (oko 39oC) se postiže tako što se, u međuprostor između tanke (unutrašnje) i debele (spoljašnje) gume veštačke vagine, sipa temperirana voda. Skliskost se postiže tako što se unutrašnji zid veštačke vagine namaže nekom neutralom mašću, dok se pritisak postiže naponom vode u međuprostoru između spoljašnjeg i unutrašnjeg zida vagine. Na suprotnom kraju veštačke vagine, od otvora kroz koji ulazi penis, fiksira se spermosabirač. Važno je da cela vagina, a posebno spermosabirač, bude zaštićen od uticaja spoljašnje temperature i svetlosti. To se postiže specijalnom navlakom. Ovom metodom se uzima sperma od bika, pastuva i ovna.

Elektroejakulacija je pomoćna metoda, koja se koristi kada priplodnjak nije u stanju da izvrši ejakulaciju primenom drugih metoda dobijanja sperme. Ova metoda se češće koristi kod malih vrsta životinja. Princip metode se satoji u tome, što se, kroz jednu bipolarnu elektordu, uvedenu u rektum mužjaka, propušta niskofrekventna struja (5, 10 ili 15V, maksimalne jačine 200mA). Ova struja stimuliše centar za ejakulaciju, koji se nalazi u lumbosakralnom delu kičmene moždine. Pre početka stimulacije, mužjak se dobro fiksira, a u rektum se ubaci 50 ml (ovan) ili 200 ml (bik) 1% vodenog rastvora NaCl, radi postizanja bolje provodljivosti električne struje. Struja se propušta u trajanju 5-6 sekundi, nekoliko puta, sa pauzama isto tolikog trajanja. Ovako dobijeni ejakulati su dobrog kvaliteta, ali imaju nešto veći volumen u poređenju sa onim ejakulatima koji se dobijaju veštačkom vaginom. To je posledica pojačane sekrecije vezikularnih žlezda, kao odgovor na električni nadražaj.

Masaža akcesornih polnih žlezda i/ili ampula semevoda je, takođe, metod kojim se može izazvati refleks ejakulacije, odnosno dobiti sperma od priplodnjaka. Izvodi se tako što se, rukom uvedenom u rektum, pronađu i masiraju vezikularne žlezde i/ili ampule semevoda. I ova metoda se koristi kod priplodnjaka koji nisu sposobni da izvrše skok. Pogodna je zbog toga što nije potrebna nikakva oprema. Međutim, po pravilu, ovako dobijen ejakulat je znatno lošijeg kvaliteta.

Prilikom uzimanja sperme, važno je znati da bik i ovan ejakuliraju vrlo kratko (za nekoliko sekundi posle skoka), da je njihov ejakulat male zapremine (bik 8 ml, ovan 1,5 ml) i velike koncentracije, kao i da ejakuliraju kompletan ejakulat. Ejakulacija kod pastuva traje duže (0,5 do 1 minut), a komponente sperme se izbacuju u frakcijama. Zapremina ejakulata pastuva je oko 70 ml. Nerast ejakulira najduže (oko 5-6 minuta), ejakulat se izbacuje u 3 frakcije, a njegova zapremina je velika (120-500 ml), ali male koncentracije.

 


METODE UZIMANJE SPERME OD NERASTA

 

Metoda manuelne fiksacije penisa

 

Metodom veštačke vagine

Shematski prikaz veštačke vagine za nerasta

1. Spoljašnji valjak od tvrde gume; 2. Unutrašnji rukavac od meke gume; 3. Ventil za sipanje tople vode u međuprostor između spoljašnje i unutrašnje gume; 4. Šupljina veštačke vagine, u koju nerast uvodi penis; 5. Prstenovi za stezanje krajeva mekog rukavca, preko otvora tvrdog valjka. 6. Spermosabirač.


METODE UZIMANJA SPERME OD BIKA

 

Metodom veštačke vagine

Veštačka vagina za bika


Spoljašnji izgled (A) i poprečni presek (B).
Prstenati sunđer na ulazu u veštačku vaginu (1); Ventil za usipanje vode (2); Spoljašnji cilindrični zid od tvrde gume (3); Međuprostor u koji se sipa temperirana voda (4); Unutrašnji cilindrični zid od meke gume (5); Gumena navlaka, kojom se spaja telo veštačke vagine sa spermosabiračem (6); Spermosabirač (7).

 

Metodom manuelne masaže vezikularnih žlezda (A) i manuelne masaže ampula semevoda (B).

 KONTROLA KVALITETA SPERME


Pod kontrolom kvaliteta dobijene sperme (ejakulata) se, pre svega, podrazumeva određivanje njegove fertilizacione sposobnosti. Osim toga, može se odrediti njegov mikrobiološki kvalitet (prisustvo patogenih i drugih mikroorganizama), kao i neke fizičko-hemijske osobine. Fertilizacioni kapacitet ejakulata se, najčešće, određuje indirektno, određivanjem nekih osobina i parametara ejakulata, koji su manje ili više povezani sa njegovom oplodnom sposobnošću. Osnovni od ovih parametara su: volumen ejakulata, ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, % progresivno pokretnih, morfološki abnormalnih i mrtvih, kao i spermatozoida sa proksimalnom citoplazmatičnom kapi.
Kontrola kvaliteta sperme se može odrediti sledećim metodama:
1     Makroskopskim,

2     Mikroskopskim i

3     Fizičko-hemijskim.

     Kvalitet dobijenog (nativnog) ejakulata se određuje neposredno posle uzimanja od priplodnjaka.
Makroskopska ocena sperme se vrši bez upotrebe posebnih instrumenat i obuhvata: određivanje volumena, boje, gustine i mirisa ejakulata, kao i eventualno prisustvo stranih (neprirodnih) materija u ejakulatu.
Volumen ejaklulata je specifičan za svaku pojedinu vrstu životinja. On se meri u graduisanom spermosabiraču. Kod domaćih životinja se kreće između 0,1-1 ml do nekoliko stotina mililitara.
Boja ejakulata je specifična za svaku vrstu priplodnjaka. Boja normalanog (dobrog) ejakulata se kreće između sivkasto-mlečno bele do žućkasto-bele boje. To zavisi od vrste priplodnjaka, kao i od gustine ejakulata. Boja ejakulata može biti znatno promenjena, u zavisnosti od vrsta stranih materija (krv, gnoj, nečistoća, mikroorganizmi).
Gustina ejakulata se određuje prema njegovoj boji, izgledu i stepenu vrtloženja. Gušći ejakulati imaju više mlečno-belo do belo-žućkastu boju, dok su ređi ejakulati bleđi i prozirniji. Osim toga, intenzitet vrtložnog kretanja se povećava sa povećanjem gustine ejakulata (zbog većeg broja, koncentracije, progresivno pokretnih spermatozoida u jedinici zapremine ejakulata). Gustina ejakulata se izražava ocenom od 1 do 5 ili opisno (retka, gusta i td.).
Miris ejakulata je specifičan za svaku vrstu životinja. Normalan ejakulat treba da ima specifičan miris vrste kojoj pripada priplodnjak, od koga je dobijen.

 Mikroskopska ocena sperme se izvodi pod svetlosnim mikroskopom i obuhvata određivanje sledećih   parametara i osobina spermatozoida: stepen (%) progresivne pokretljivosti, ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, broj živih, mrtvih i morfološki promenjenih, prisustvo koagulacije spermatozoida, prisustvo stranih materija (krv, gnoj, epitelne ćelije, nečistoća) i prisustvo mikroorganizama.
Progresivna pokretljivost se izražava procentom progresivno pokretnih, od ukupnog broja spermatozoida u vidnom polju. Samo progresivno pokretni spermatozoidi su sposobni za oplodnju. Spermatozoidi se mogu kretati i cirkularno, talasasto, spiralno ili mogu biti nepokretni. Progresivna pokretljivost je osobina, koja je vrlo značajno povezana sa oplodnom sposobnošću spermatozoida.
Broj živih spermatozoida se određuje različitim metodama brojanja: (1) metoda hemocitometrije i (2) metoda fotometrije. Prva metoda se češće koristi u praksi. Za ovu metodu je potreban svetlosni mikroskop, komorica za brojanje eritrocita (hemocitometer), melanžer za eritrocite ili leukocite (zavisno od vrste životinja) i 3% vodeni rastvor NaCl. Postupak brojanja: Pod mikroskop se postavi hemocitometer i, na malom uvećanju, se pronađe mrežica (komorica) za brojanje. Zatim se, u melanžer uvuče nativna sperma, do oznake 0,5, a 3% NaCl do oznake 11 (kod melanžera za leukocite), ili do oznake 101 (kod melanžera za eritrocite). Tako se, u melanžeru, napravi razređenje sperme u odnosu 1:20 ili 1:200. Eritrocitarni melanžer se koristi za gustu spermu (bik, ovan, jarac), a leukocitarni za retku spermu (nerast, pastuv). Palcem i srednjim prstom se zatvore krajevi melanžera i promućka se nekoliko puta. Prva kap, iz kapilare melanžera, se ispusti, a ostatak se ubaci između pokrovne pločice i stakla hemocitometra. Objektiv mikroskopa se podesi na srednje uveličanje i broje se spermatozoidi, koji se nalaze u 5 srednjih (80 malih) kvadratića mrežice.

BROJANJA SPERMATOZOIDA METODOM
HEMOCITOMETRIJE

Hemocitometar za brojanje spermatozoida

 

Melanžer za eritrocite (A) i leukocite (B). Kapilara (1), bulbus (2) gumena cevčica (3), plastična sisaljka za usta, crvena kod eritrocitarnog, a bela kod leukocitarnog melanžera (4) i plastična perlica, za bolje mešanje sperme i NaCl (5).

Mrežica komorice za brojanje spermatozoida (levo). Spermatozoidi se broje u 5 velikih kvadrata mrežice (desno).


Metodom hemocitometrije se broje spermatozoidi u malom uzorku razređene sperme, a zatim se, izračunavanjem dobija broj spermatozoida u 1ml nativne sperme, odnosno u celokupnom ispitivanom ejakulatu.

Postupak:

1 U melanžeru se izvrši razreživanje i umrtvljavanje spermatozoida. Ako se ispituje sperma nerasta ili pastuva (koja je male koncentracije), koristi se melanžer za leukocite. Nativna sperma se uvuče u melanžer do oznake 0,5. Zatim se uvlači 3% (hipertonični) rastvor NaCl, do oznake 11. Tako se dobije razređenje nativne sperme u odnosu 1:20. Hipertonični rastvor NaCl ubija spermatozoide, kako se ne bi kretali u komorici za brojanje. Ako se ispituje sperma preživara (bik, ovan, jarac), koristi se melanđer za eritrocite, jer se, u njemu, prave veća razređenja (1:100 – ako se sperma uvuče do oznake 1, a rastvor NaCl do oznake 101 ili 1:200 -ako se sperma uvuče do oznake 0,5, a rastvor NaCl do oznake 101).

2 Zatim se melanžer promućka, posle čega se jedna kap izduva iz njegove kapilare (tu je ostao samo rastvor NaCl). Ostatak sadržaja melanžera se izduva ispod pokrovnog stakla, na komorici hemocitometra, postavljenoj ispod svetlosnog mikroskopa.

3 Pod malim uvećanjem mikroskopa, pronađe se cela mrežica komorice za brojanje. Zatim se, pod srednjim uveličanjem, u vidno polje mikroskopa, postavi jedan veliki kvadrat mrežice (oivičen je sa dve tanke crte).

4 Kada se spermatozoidi potpuno umire (uginu), pristupa se njihovom brojanju u svakom od 5 odabranih (od ukupno 16) velikih kvadrata mrežice. Obično se broje 4 kvadrata u uglovima i jedan u sredini, idući sleva na desno, u obliku slova “Z”. Broj izbrojanih spermatozoida u svakom kvadratu se zabeleži. Time je postupak brojanja u hemocitometru završen.

5 Pristupa se izračunavanju broja spermatozoida u 1ml nativne sperme, odnosno u celokupnom ispitivanom ejakulatu.

Primer izračunavanja:

Ispitivan je ejakulat nerasta, zapremine 200ml (V = 200ml). U melanžeru za leukocite je napravljeno razređenje nativne sperme, u odnosu 1 : 20 (r = 20). U 5 velikih kvadrata, ukupno je izbrojano 150 spermatozoida (n = 150). Izračunavanje ukupnog broja (koncentracije - C) spermatozoida u 1ml nativne sperme, vrši se po formuli: C = n x r x 50.000 C -ukupan broj spermatozoida u 1ml nativne sperme; n -broj spermatozoida izbrojan u 5 velikih kvadrata mrežice hemocitometra; r - stepen razređenja, napravljen u melanžeru; 50.000 -koeficijent komorice za brojanje.

Ako, u formuli, zamenimo vrednosti date u našem primeru, dobijamo: C = 150 x 20 x 50.000 = 3.000 x 50.000 = 15.000.000 sptz./ml. Znači: u 1ml ispitivanog nativnog ejakulata, ima 150 miliona (150 x 106) spermatozoida. Kako ispitivani ejakulat ima zapreminu 200ml, to u celom ejakulatu ima 150.000.000 x 200 = 30.000.000.000 (30 x 109) spermatozoida. Pre početka brojanja, u uzorku nativne sperme, zagrejane na + 37oC, pod svetlosnim mikroskopom, izvrši se ocena broja progresivno pokretnih spermatozoida, izražena u %, od ukupnog broja spermatozoida u vidnom polju mikroskopa. Uzmimo, da je, u našem primeru, bilo 80% progresivno pokretnih spermatozoida. Kod detaljnijih analiza kvaliteta ejakulata, može se napraviti i trajni, obojen preparat, na kome se mogu videti morfološki promenjeni, kao i mrtvi spermatozoidi. Za praksu je naj jednostavnije napraviti preparat bojenjem po Blom-u.

Postupak bojenja preparata sperme po Blom-u:
1 Na čistu staklenu predmetnu pločicu, zagrejanu na +37oC, stavi se vrlo mala kap nativne sperme (veličine čiodine glave), pored nje duplo veća kap 5% vodenog rastvora nigrozina (crna histološka boja) i troduplo veća kap 10% vodenog rastvora eozina (crvena histološka boja).
2 Sada se, staklena pokrovna ljuspica postavi pod uglom od oko 45o na predmetnu pločicu, pored kapi sperme i boje, pa se napravi vrlo tanak razmaz po predmetnom staklu. Boja dobrog razmaza treba da je svetlo karmin-crvena.
3 Ovako napravljen preparat se, brzo, osuši (prevlačenjem iznad plamena plamenika), ali da se ne zagaravi.
4 Takav trajni preparat se posmatra pod svetlosnim mikroskopom. Spermatozoidi, čije su glave obojene crveno, su bili mrtvi pre početka pravljenja preparata, jer je ćelijska membrana mrtvog spermatozoida propustila u citoplazmu crvenu boju – eozin. Ćelijske membrane živih spermatozoida su selektivno propustljive i ne propuštaju velike molekule eozina. Zbog toga su njihove glave, pod mikroskopom, providne (nisu obojene crveno). Mogu se videti i spermatozoidi sa različitim anomalijama građe glave i repa, kao i spermatozoidi sa citoplazmatičnom kapi (to so spermatozoidi koji nisu završili sazrevanje u epididimisu). Ova citoplazmatična kap može biti postavljena na repu spermatozoida, odmah iza glave (proksimalna citoplazmatična kap) ili dalje od glave (distalna citoplazmatična kap). Spermatozoidi sa proksimalnom citoplazmatičnom kapi su nezreli i nisu sposobni da izvrše fertilizaciju oocita.

Oblici spermatozoida i nekih ćelija, koji se mogu naći u spermi:
Normalni spermatozoidi (A), različiti oblici morfoloških deformacija spermatozoida (B) i različite nenormalne ćelije u spermi (C): forme spermatozoida u obliku meduze (a), epitelne ćelije (b), okruglaste ćelije (c), eritrociti (d) i gnojne ćelije (e).

Fizičko-hemijske metode ocene kvaliteta sperme su: Temperaturni (hladan) šok, ocena pH vrednosti, određivanje stepena glikolize i respiracije spermatozoida, obezbojavanje metilenskog plavog i test inkubacije.


Hladan šok je test preživljavanja spermatozoida u vodenom kupatilu, na 0ºC, tokom 10 minuta. Procentualni odnos živih i mrtvih spermatozoida, posle temperaturnog šoka, govori o stepenu vitalnosti spermatozoida.
pH vrednost sperme je specifična za svaku vrstu, ali se kreće u granicama od 6,7 do 7,2 i veoma je bitna za održavanje oplodne sposobnosti spermatozoida.
Vrednost respiracije, tj. potrošnje kiseonika i njegove konverzije u CO2, tesno je povezana sa stepenom glikolize u spermatozoidima.
Obezbojavanje metilen-plavog. Potrošnja kiseonika, u spermi sa visokom koncentracijom vitalnih spermatozoida, znatno je viša od one u spermi sa nižom koncentracijom ovakvih spermatozoida. Brzina obezbojavanja metilen-plavog, kao posledica oksido-redukcijske reakcije, služi kao indirektan način određivanja stepena potrošnje kiseonika, odnosno stepena životne aktivnosti spermatozoida.
Inkubacija spermatozoida na temperaturi od 46ºC, tokom 45 minuta, povećava sve biohemijske procese spermatozoida. Tako oni brže troše kiseonik i hranljive materije iz spermalne tečnosti. Određivanjem odnosa broja živih spermatozoida pre i posle inkubacije, meri se vitalnost, odnosno oplodna sposobnost spermatozoida. Sperma je kvalitetnija, ako se, u njoj, posle inkubacije, nađe veći broj živih spermatozoida.
 

RAZREĐIVANJE EJAKULATA I FORMIRANJE INSEMINACIONIH DOZA SPERME
 

Stepen razređenja (odnos volumena ejakulata i volumena razređivača) se određuje na osnovu sledećih parametara: volumen ejakulata, koncentracija i ukupan broj spermatozoida, % progresivne pokretljivosti, broj mrtvih i morfološki abnormalnih spermatozoida, tolerancija datog ejakulata na određen (maksimalan) stepen razređenja i na maksimalnu dužinu čuvanja u tom razređenju, kao i od broja, odnosno volumena, inseminacionih doza, koji se želi napraviti od datog ejakulata. Posle razređenja, sperma se stavi u vodeno kupatilo, na +370C, u trajanju oko 30-60 minuta, da se stabilizuje.
U našem primeru, imali smo ejakulat nerasta, zapremine 200ml, u kome se nalazi ukupno 30 milijardi spermatozoida, od kojih je progresivno pokretno 80% ili 24 milijarde. Ovaj broj progresivno pokretnih spermatozoida, koristimo da izračunamo broj doza, koje možemo napraviti od datog ejakulata.
Jedna doza tečne razređene sperme, za (klasično) intracervikalno osemenjavanje svinja, treba da sadrži 2 do 5 milijardi progresivno pokretnih spermatozoida. Uzmimo primer da jedna doza sadrži 2 milijarde progresivno pokretnih spermatozoida. Znači, od ejakulata iz našeg primera, može da se napravi 12 inseminacionih doza (24 : 2 = 12).
        Svaka doza treba da ima zapreminu od 100ml razređene sperme. To znači da će, u našem primeru, ukupna zapremina 12 doza iznositi 1.200ml. Kako ejakulat, iz našeg primera, ima zapreminu 200ml nativne sperme, u njega treba da dospemo 1.000ml razređivača. Tako smo dobili zapreminu od 1.200ml razređene sperme, koju razdelimo u 12 bočica, od kojih svaka ima zapreminu 100ml razređene sperme (to su inseminacione doze).
Svi postupci manipulacije sa spermom, od uzimanja do razređivanja, rade se na sobnoj temperaturi (200C ), a sve što dolazi u direktan kontakt sa spermom (spermosabirač, predmetnice, pokrovne pločice, melanžeri, menzure, bočice za inseminacione doze i razređivač), kao i sama sperma, moraju biti zagrejani na +37ºC.
       Posle razređivanja, doze tečne razređene sperme nerasta se, do inseminacije, čuvaju na temperaturi +17ºC. U zavisnosti od primenjenog razređivača, doze tečne razređene sperme nerasta se mogu čuvati, na ovoj temperaturi, kratkotrajno (do 3 dana) ili dugotrajno (4 do 14 dana). Treba imati na umu da oplodna sposobnost spermatozoida pada sa dužinom čuvanja in vitro!
Inseminacione doze se mogu dugotrajno čuvati (više desetina godina) dubokim zamrzavanjem u pari tečnog azota, na temperaturi -196ºC. Ovom metodom dubok zamrzavanja, vrlo uspešno se čuvaju inseminacione doze bika, ovna i jarca, a znatno manje uspešno doze nerasta i pastuva.


OPTIMALNO VREME I TEHNIKA VO


Optimalno vreme osemenjavanja. Maksimalna vrednost uspešne koncepcije se postiže osemenjavanjem izvedenim 10-12h pre ovulacije. Kako moment ovulacije, u praktičnim uslovima, nije moguće precizno odrediti na direktan način, to se ovaj moment određuje u odnosu na početak estrusa. Ustanovljeno je da su početak manifestacije standing estrusa, kao i njegovo trajanje, značajno povezani sa momentom ovulacije. Zbog toga se optimalno vreme inseminacije određuje na osnovu što preciznije ustanovljenog početka standing estrusa. Kako je trajanje estrusa različito kod vrsta različitih životinja, to je i optimalno vreme osemenjavanja različito, ali je uvek oko 12h pre ovulacije.

* Bez obzira na trajanje estrusnog perioda; ** Interval zalučenje-estrus je obrnuto proporcionalan trajanju estrusa. Zbog toga, krmače sa kraćim trajanjem IZE treba osemenjavati kasnije, a one sa dužim trajanjem IZE ranije posle početka standing estrusa.

Tehnika veštačke inseminacije je, takođe, vrlo bitan faktor uspeha VO. Sastoji se u tome da se, pogodnim instrumentima i na pogodan način, sperma unese u određeni deo reproduktivnog trakta ženke. Instrumenti i način unošenja sperme su specifični za pojedine vrste životinja, što je uslovljeno (a) anatomskom građom i veličinom ženskih polnih organa, (b) mestom u reproduktivnom traktu gde sperma treba da bude deponovana i (c) volumenom i drugim karakteristikama inseminacione doze.
Inseminacija krave se vrši specijalnim tankim kateterom, dužine oko 50 cm i debljine oko 5 mm, koji se, kroz vulvu i vaginu, uvodi u grlić materice, gde se deponuje doza sperme. Kateter se može uvesti u cervikalni kanal: (a) metodom transrektalne manuelne fiksacije cerviksa i (b) metodom vaginalnog spekuluma. Obe metode imaju svoje prednosti i mane.
Inseminacija ovce se vrši na sličan način kao kod krave. Inseminacioni kateter je nešto kraći, prilagođen dimenzijama polnog trakta ovce. Kako je ovca mala, mnogo je lakše uvesti kateter metodom vaginalnog spekuluma. Važno je da se kateter uvede bar 1-2 cm u cervikalni kanal, gde se deponuje doza sperme.
Inseminacija krmače traje duže, jer se: (a) ubacuje znatno veća doza sperme (80-100 ml) i (b) ova doza se raspoređuje u oba roga uterusa, naizmeničnim kontrakcijama rogova, u toku 3 do 6 minuta. Vrh katetera se uvodi do zadnje trećine cervikalnog kanala, tako da se doza sperme deponuje u telo materice. Pri tome se ne koristi ni vaginalni spekulum, ni rektalna fiksacija cerviksa. Važno je da istiskivanje sperme traje onoliko dugo, koliko krmača sama usisava spermu!
Inseminacija kobile se izvodi tako što se kateter, dugačak 50-70 cm i prečnika 6 mm, uvede, kroz cervikalni kanal, do tela materice, gde se doza sperme, pomoću brizgalice, deponuje.
Inseminacija kuje i mačke se vrši uvođenjem katetar u vaginu, gde se deponuje doza sperme.



         Uvođenje katetera u cerviks krave i u vođenje katetera u cerviks krmače
        rektalnom fiksacijom cerviksa
 

 

1    Kateter za inseminaciju
2    Vaginalni spekulum
3    Telo cerviksa
4    Kanal cerviksa
5    Telo materice
6    Rektum
7    Mokraćna bešika
8    Sinfiza pelvis

Uvođenje katetera u cerviks ovce, primenom vaginalnog spekuluma
 

 

TRANSPLANTACIJA EMBRIONA

Transplantacija embriona (embriotransfer, ET) je biotehnologija, putem koje se embrioni jedne genetski superiorne plotkinje (davaoc, donator) presađuju (transplantuju) u matericu druge ženke (primaoc, recipijent), koja služi kao fiziološka (surogat) majka, odnosno završava gravidnost do kraja. Na ovaj način, višekratnim uzimanjem većeg broja embriona od jednog donatora, moguće je dobiti znatno veći broj njegovih potomaka, nego što bi to bilo moguće prirodnim ritmom reprodukcijue.
Primenom ove tehnologije, moguće je:
•    Dobijanje znatno većeg broja potomaka od jedne, genetski superiorne, ženke.
•    Dugotrajno čuvanje embriona od određene ženke.
•    Lakši transport embriona na veće udaljenosti
•    Izbegavanje rizika transporta, aklimatizacije i karantina  genetski visokovrednih ženki.
•    Sprečavanje širenja zaraznih bolesti.
•    Definisanje pola dobijenih potomaka.
•    Ekonomska korist od prodaje embriona.

Tehnologija transplantacije embriona obuhvata sledeće postupke:
•    Superovulacija donatora se izvodi tretmanom donatora većim dozama gonadotropina (PMSG i HCG ili FSH i LH).
•    Sinhronizacija estrusnih ciklusa donatora i recipijenata, primenom adekvatnih hormonskih tretmana (videti poglavlje o sinhronizacije estrusa).
•    Prikupljanje embriona od donatora se može izvesti hirurškom metodom (putem laparotomije ili laparoskopije) ili nehirurškom metodom (ispiranjem embriona iz uterusa, primenom pogodnih katetera, koji se uvode u vrhove rogova uterusa kroz vaginu i cerviks).
•    Kontrola kvaliteta dobijenih embriona se vrši u laboratoriji, pod svetlosnim ili faznokontrastnim mikroskopom. Koriste se samo embrioni koji su morfološki potpuno ispravni.
•    Kratkotrajno ili dugotrajno čuvanje embriona od momenta uzimanja do momenta transplantacije. Mogu se čuvati u tečnom medijumu, kratko (nekoliko sati) ili u posebnom medijumu, dugotrajno, dubokim zamrzavanjem.
•    Transplantacija embriona u recipijente se može izvesti hiruruškim ili nehiruruškim putem. 

Osnovni postupci embriotransfera goveda i razdvajanje muških i ženskih spermatozoida protočnom citometrijom

 

SEXING – ODREĐIVANJE POLA SPERMATOZOIDA I EMBRIONA

 

Proizvodnja mesa se znatno povećava, ako se tove samo muška grla, koja imaju znatno bolju konverziju hrane i veći dnevni prirast od ženskih. Veći broj muških grla se može obezbediti kontrolom odnosa polova rođenih jedinki, tako što se: (a) izvrši razdvajanje spermatozoida na “muške” (sa Y-hromozomom) i “ženske” (sa X-hromozomom), ili (b) razdvajanjem ranih embriona na ženske i muške.
U poslednje vreme se koriste dosta precizne metode razdvajanja muških i ženskih spermatozoida: (a) metoda protočne citometrije i (b) metoda specijalnog bojenja spermatozoida, fluorescentnom bojom, koja se vezuje za specifičan segment na Y-hromozomu. Kada se takvi spermatozoidi osvetle ultravioletnom svetlošću, muški daju ljubičastu boju, dok ženski nisu obojeni i oni su svetli.
 Određivanje pola ranih embriona se vrši specijalnom metodom replikacije specifičnog segmenta DNK, na Y-hromozomu, ili imunološkom metodom, kojom se detektuje specifičan antigen za muške ćelije (H-Y antigen). Ovaj antigen se nalazi na površini blastomera muških embriona, dok ga kod ženskih plodova nema. Obe metode zahtevaju biopsiju ranog embriona (morule), radi uzimanja jednog broja blastomera za testiranje. Pol embriona se može predodrediti i tako što se oocit mikroinjektira samo jednim spermatozoidom, poznatog pola (sa X ili
Y-hromozomom).

FERTILIZACIJA IN VITRO

Oplodnja (fertilizacija) oocita se može izvršiti u jajovodu ženke (in vivo) ili u laboratorijskim uslovima, izvan organizma ženke (in vitro). Za in vitro fertilizaciju je potrebno obezbediti posebne uslove, kojima se, što je moguće bolje, imitiraju uslovi koji vladaju u jajovodu, prilikom in vivo fertilizacije. To su, pre svega, medijumi određenog hemisjkog sastava, temperatura, pritisak, koncentracija CO2, zreli oociti (u stadijumu MfII), kapacitirini spermatozoidi i td. Mogu se koristiti oociti isprani iz jajovoda, posle superovulacije, ili tzv. folikularni oociti, dobijeni iz jajnika živih životinja (hiruruškim putem, laparotomojom ili laparoskopijom) ili iz jajnika uzetih neposredno posle žrtvovanih životinja.
Folikularni oociti se dobijaju aspiracijom vidljivih antralnih folikula na površini jajnika, ili totalnom resekcijom jajnika. U oba slučaja, većina dobijenih oocita (preko 95%) se nalaze u diplotenu prve mejotičke deobe. Tako de se jedro ovih oocita nalazi u obliku germinativnog vezikula (GV-oociti). Ovakvi oociti nisu sposobni za oplodnju, nego ih treba podvrgnuti procesu dozrevanja (maturacije) in vitro (IVM). Posle oko 24h sata kultivacije oocita, u kultivacionom medijumu, većina oocita postaje zrela, jer dostiže stadijum metafaze druge mejoze (MfII), i sposobni su za oplodnju. Pre kultivacije, folikularni oociti moraju biti denudirani, tj. moraju se odstraniti kumulusne ćelije sa zone pelucide, s obzirom na to da se živi folikularni oociti dobijaju u obliku kumulus-oocitarnog kompleksa. Prisustvo kumulusnih ćelija inhibira nastavak deobe nukleusa!



 

Oocit sa kumulusom (kumulus-oocitarni kompleks), neposredno posle aspiracije iz folikula (levo) i posle 24 sata kultivacije in vitro (zreo oocit, jer se, u perivitelusnom prostoru, nalazi prvo polarno telašce) (desno).

 

POSTUPAK DOBIJANJA HIMERA


Pojam himere označava jedinku nastalu veštačkom kombinacijom dva ili više različitih genoma (vrsta). Na primer, iz blastocista kobile, izvadi se unutrašnja ćelijska masa (iz koje bi se razvio plod konja), pa se, na to mesto, ubaci unutrašnja ćelijska masa zebre, izvađena iz blastocista zebre. Tako kobila oždrebi zebru, a ne meleza između konja i zebre. Himere nemaju praktičan značaj u stočarstvu, nego se koriste u naučnim istraživanjima.


 

« Nazad
Pančevački put 105, Krnjača, Beograd
+381 11 27 11 292
+381 11 27 48 183
svckrnjaca@gmail.com

Back to Top